近年來，腫瘤免疫療法給無數(shù)的腫瘤患者帶來了希望。免疫檢查點療法是當(dāng)前腫瘤免疫治療的核心，PD-1或是其配體PD-L1以及CTLA4抗體在部分腫瘤治療過程中表現(xiàn)非常優(yōu)越。這也逐漸讓免疫檢查點療法成為臨床一線標準療法。由此可見，免疫檢查點療法的重要性不言而喻，這也讓該領(lǐng)域的開創(chuàng)者James Allison 和 Tasuku Honjo 贏得了2018年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。然而，對于患有膠質(zhì)母細胞瘤（Glioblastoma, GBM）的患者而言，免疫檢查點療法的作用微乎其微。這也許跟膠質(zhì)母細胞瘤以及大腦環(huán)境的特殊性密切相關(guān)。

膠質(zhì)母細胞瘤是一種非常常見并且致死率最高的一類腦瘤，患者的生存期一般不超過15個月。目前主要的治療手段是手術(shù)，化療和放療，但這些都只能短期內(nèi)產(chǎn)生部分療效，且具有較強的毒副作用【1】。在過去的25年里，膠質(zhì)母細胞瘤的治療并沒有突破性的進展，除了替莫唑胺藥物化療結(jié)合放療可以稍微延長患者的生存時間。目前為止還沒有免疫治療相關(guān)的藥物可用于膠質(zhì)母細胞瘤的治療。除了免疫檢查點治療外，嵌合抗原受體T細胞（CAR-T）是另一類非常有希望攻克腫瘤的治療手段，其原理主要是通過改造T細胞的基因使其可以更加特異的識別腫瘤抗原，并高效的將腫瘤細胞殺死。這類系統(tǒng)已經(jīng)在血液瘤治療中得到了充分的證明，美國FDA已經(jīng)批準了多款CAR-T治療方案用于血液瘤的臨床治療。CAR-T治療在實體瘤中仍然面臨諸多困難，膠質(zhì)母細胞瘤又是實體瘤中難治的代表之一。總而言之，目前尚沒有很好的免疫檢查點和CAR-T治療手段可以用于臨床的膠質(zhì)母細胞瘤的治療。因此，尋找和開發(fā)更加高效的實體瘤免疫治療手段是當(dāng)前的研究熱點，同時也是該領(lǐng)域的難點。

2019年9月23日，來自美國耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的陳斯迪（Sidi Chen）團隊在Nature Biotechnology上發(fā)表題為In vivo CRISPR screening in CD8 T cells with AAV–Sleeping Beauty hybrid vectors identifies membrane targets for improving immunotherapy for glioblastoma 的一項研究。作者從膠質(zhì)母細胞瘤模型入手，通過CRISPR篩選技術(shù)并結(jié)合腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus，AAV）和“睡美人”（Sleeping Beauty）轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)篩選得到了多個新型的腫瘤免疫治療新靶點。該項目第一作者是葉露鵬博士和MD/PhD學(xué)生Jonathan Park（樸俊英）和Matthew Dong（曾家寶） 。值得一提的是，這是該團隊繼上個月在Cell上發(fā)表的第二篇關(guān)于CRISPR篩選用于腫瘤免疫治療新靶點發(fā)現(xiàn)的文章，Matthew Dong和葉露鵬博士同樣是Cell文章的第一作者 （詳見BioArt報道：Cell | 陳斯迪組首次在CD8 T 細胞中實現(xiàn)體內(nèi)全基因組CRISPR 篩選并發(fā)現(xiàn)全新的免疫治療新靶點）。

作者首先構(gòu)建了一個膜蛋白相關(guān)的基因敲除文庫，希望通過CRISPR 篩選技術(shù)找出全新的免疫治療新靶點。高效的基因編輯鼠源CD8 T 細胞一直是該領(lǐng)域的難點，常規(guī)的細胞轉(zhuǎn)染和慢病毒遞送方法都無法實現(xiàn)高效的基因打靶。在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)用腺相關(guān)病毒（AAV）遞送sgRNA可以很好的實現(xiàn)基因打靶。然而，AAV是一類非整合的病毒，隨著細胞的增殖，AAV 會慢慢的丟失。為了能讓AAV遞送的DNA元件可以整合到細胞的基因組，研究人員在AAV 載體上裝了一個超高活性的“睡美人”轉(zhuǎn)座子，這樣可以利用轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)將包裹在AAV 中的DNA元件整合到基因組中，這在后續(xù)的篩選實驗中非常重要。研究人員將膜蛋白相關(guān)的基因打靶文庫克隆到AAV-SB-CRISPR 在體中，然后包裝成AAV病毒之后感染CD8 T 細胞，最后將T 細胞通過尾靜脈注射到患有GBM的小鼠體內(nèi)。篩選結(jié)果顯示Pdia3，Mgat5，Emp1，Lag3，Pde5a，Ccdc80，Defb26等多個基因得到了高度的富集。值得一提的是，研究人員做了三次獨立的在體篩選，發(fā)現(xiàn)Pdia3，Mgat5和Emp1驚人的富集在三次的篩選中。

為此，在后續(xù)的驗證實驗中研究人員重點對Pdia3, Mgat5和Emp1這三個基因進行了驗證，尤其是Pdia3，在免疫治療領(lǐng)域從來沒有被報道過。在抗原和CD8 T 細胞特異識別的實驗中，作者發(fā)現(xiàn)Pdia3, Mgat5或Emp1敲除的CD8 T 細胞可以增強T細胞的抗腫瘤活性，延長了小鼠的生存時間。與對照組相比，腫瘤浸潤T細胞的比例也有了顯著地提高。研究人員還嘗試了顱內(nèi)直接注射Pdia3或Mgat5敲除的CD8 T 細胞，發(fā)現(xiàn)同樣可以延長小鼠的生存時間。跟進實驗結(jié)果顯示 Pdia3敲除后顯著地提高了促炎癥相關(guān)基因的表達， 結(jié)果顯示T 細胞激活信號通路（T cell signaling pathway）變得更加靈敏，只需低濃度的CD3刺激便可快速的激活T細胞. 研究人員嘗試了三陰乳腺癌模型，發(fā)現(xiàn)T細胞Pdia3敲除也可以明顯的限制腫瘤的生長. 作者同樣在人CD8 T 細胞中進行了驗證。研究人員首先建立了PDIA3敲除的人CD8 T細胞，發(fā)下PDIA3敲除之后同樣提高了 T 細胞功能和一些共刺激因子的表達。最后作者構(gòu)建了膠質(zhì)母細胞瘤的CAR-T 細胞，在體外殺傷實驗中，PDIA3敲除的EGFRvIII CAR-T細胞具有更強的腫瘤殺傷能力。

總之，本研究對傳統(tǒng)CRIPSR篩選技術(shù)進行了優(yōu)化，將CRISPR篩選系統(tǒng)與AAV和轉(zhuǎn)座子結(jié)合起來，提供了一個全新且高效的CRIPSR篩選方法。作者利用該方法對膜蛋白進行了篩選，最終得到了多個全新的腫瘤治療新靶點，為今后抗腫瘤免疫治療提供了新思路和新手段。