隨著CRISPR/Cas 基因編輯系統(tǒng)的誕生，其在植物領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用和開發(fā)新的用途，日新月異，發(fā)展迅速。因此，我們經(jīng)《華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)》授權(quán)轉(zhuǎn)載了最新綜述文章：劉耀光, 李構(gòu)思, 張雅玲, 等. CRISPR/Cas 植物基因組編輯技術(shù)研究進(jìn)展 [J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2019, 40(5): 1-12. 以便讓大家細(xì)細(xì)品讀，快速了解該領(lǐng)域發(fā)展現(xiàn)狀！

 

摘要: 基因編輯技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用為植物功能基因研究和作物遺傳改良提供了重要的技術(shù)支撐。近年誕生的CRISPR/Cas 基因編輯系統(tǒng) (主要包括 CRISPR/Cas9 和 CRISPR/Cas12a) 與其他的基因編輯技術(shù)相比，具有操作簡 單、效率高等優(yōu)勢(shì)，因此在動(dòng)植物中均得到廣泛應(yīng)用。本文結(jié)合 CRISPR/Cas 基因編輯技術(shù)體系的發(fā)展歷史及最新 研究進(jìn)展，著重介紹了該技術(shù)在植物領(lǐng)域中的應(yīng)用范圍和發(fā)展方向，以及基因編輯植物的靶點(diǎn)分析方法；對(duì)目前 CRISPR/Cas 基因編輯技術(shù)體系存在的問題進(jìn)行了分析并提出了改進(jìn)策略。

 

 

基因功能的鑒定和作物新品種的選育離不開 突變體的獲得，之前突變體的獲得主要依靠自然突 變、物理或化學(xué)誘變以及T-DNA 隨機(jī)插入等手段[1]。這些方法存在突變效率低、突變位點(diǎn)隨機(jī)等缺陷，且后續(xù)還需要通過圖位克隆等耗時(shí)耗力的技術(shù)手段才能最終確定突變基因。因此，在特定的位點(diǎn)引入核苷酸變異，實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)編輯能高效地獲得目標(biāo)突變體，從而加快基礎(chǔ)研究和遺傳育種的進(jìn)程。基因編輯技術(shù)主要是利用序列特異性核酸酶 (Sequence specific nucleases, SSNs) 在特定基因位點(diǎn)產(chǎn)生 DNA 雙鏈斷裂，借助編輯受體自身的 DNA 修復(fù)系統(tǒng)在非同源末端連接 (Non-homologous end joining, NHEJ) 過程中產(chǎn)生隨機(jī)的 Indels(Small insertions and deletions) 或在同源重組修復(fù)過程中 插入或替換相應(yīng)的基因片段，最終實(shí)現(xiàn)基因組序列 的突變?，F(xiàn)有的基因編輯系統(tǒng)主要包括鋅指核酸酶 (Zinc finger nucleases, ZFNs) 系統(tǒng)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶 (Transcription activator-like effector nucleases, TALENs) 系統(tǒng)以及 CRISPR/Cas (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat-associated protein) 系統(tǒng)[2] ，其中，CRISPR/ Cas 系統(tǒng)由于載體構(gòu)建過程簡單、編輯效率高等優(yōu) 點(diǎn)，成為當(dāng)前廣泛應(yīng)用的主流基因編輯系統(tǒng)。本文回顧了CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)和編輯技術(shù)體系建 立的歷程，介紹了CRISPR/Cas 編輯技術(shù)在植物中的應(yīng)用以及編輯結(jié)果的分析方法，并展望了 CRISPR/ Cas 基因編輯技術(shù)以及編輯靶點(diǎn)分析技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)。

 

 

 

1 CRISPR/Cas 免疫系統(tǒng)的作用機(jī)制和分類

 

 

 

科學(xué)家們對(duì) CRISPR/Cas 免疫系統(tǒng)的研究早在 30 年前就已經(jīng)開始。1987 年，日本研究團(tuán)隊(duì)在研究大腸埃希菌 Escherichia coli 堿性磷酸酶的同工酶基因 iap 的時(shí)候發(fā)現(xiàn)，在該基因的 3＇端存在特殊的側(cè)翼結(jié)構(gòu)，即 29 bp 的高度相似序列分別被 32 bp 序列間隔，形成了 5 個(gè)拷貝的串聯(lián)重復(fù)序列[3]。但該團(tuán)隊(duì)并未對(duì)此現(xiàn)象進(jìn)行更深入的研究。Mojica 等[4-5] 對(duì)此產(chǎn)生了濃厚的興趣，他們利用生物信息學(xué)檢索探究，在 20 多種微生物中都發(fā)現(xiàn)了類似的短 序列重復(fù)結(jié)構(gòu)，并將這種短序列重復(fù)結(jié)構(gòu)命名為規(guī)則的短間隔重復(fù) (Short regularly spaced repeats， SRSRs)；提出 SRSRs 可能存在于原核生物基因組， 包括所有嗜熱細(xì)菌和古細(xì)菌中以及部分的藍(lán)藻和變形菌門生物；總結(jié)了 SRSRs 的基本特征：24~ 40 bp 的短回文序列 (回文區(qū)可達(dá) 11 bp) 成簇存在， 并被非重復(fù)的 20~58 bp 序列間隔開來。2002 年，為了更貼切地表示 SRSRs 的特征以及避免命名的混亂，Jansen 與 Mojica 商定將 SRSRs 更名為成簇有規(guī)律的間隔短回文重復(fù)序列 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)。Jansen 等[6] 發(fā)現(xiàn)大部分種類的原核生物具有 2 個(gè)或 2 個(gè)以上的 CRISPR 基因座前導(dǎo)序列，而這些 CRISPR 基因座前端共享一個(gè) 300~500 bp 的種間 保守前導(dǎo)序列，并通過比較 CRISPR 基因座側(cè)翼的基因組信息，鑒定出不同原核生物中高度相似的 4 個(gè) CRISPR 關(guān)聯(lián)基因：Cas1~Cas4。2005 年，Mojica 等[7] 再次發(fā)表了對(duì) CRISPR/Cas 系統(tǒng)研究的最新結(jié) 果，他發(fā)現(xiàn) CRISPR 中的間隔序列大部分來自噬菌 體或接合質(zhì)粒，并且攜帶某一噬菌體片段的細(xì)菌具 有對(duì)相應(yīng)噬菌體的抵抗力；CRISPR 基因座存儲(chǔ)了病原菌的基因信息，可能是微生物適應(yīng)性免疫系統(tǒng) 的一部分。隨后，另有 2 個(gè)科研團(tuán)隊(duì)也發(fā)表了相近 結(jié)果的論文[8-9]。2007 年，Barrangou 等[10] 證明了在 噬菌體攻擊后，篩選到的抗性細(xì)菌的 CRISPR 區(qū)整 合了新的間隔序列，而間隔序列正是來源于噬菌體 DNA，也就是說，細(xì)菌通過識(shí)別與噬菌體序列相同 的 CRISPR 間隔區(qū)對(duì)應(yīng)的特定序列，獲得對(duì)噬菌體 的抗性，產(chǎn)生適應(yīng)性免疫能力；還確認(rèn)了 CRISPR 關(guān)聯(lián)基因 Cas7 幫助細(xì)菌獲得新的間隔序列和重 復(fù)，Cas9 則發(fā)揮了核酸切割酶的作用，為細(xì)菌免疫 系統(tǒng)所必需。隨后的幾年，CRISPR 細(xì)菌免疫系統(tǒng) 的必要條件和作用機(jī)制相繼被發(fā)現(xiàn)和證實(shí)，如 CRISPR 中依靠重復(fù)序列形成的 crRNA 是 CRISPR 產(chǎn)生抵抗力的關(guān)鍵[11] ，Cas9 切割的對(duì)象是 DNA[12] ， 且對(duì) DNA 的精準(zhǔn)切割的位點(diǎn)與 crRNA 特定序列 和 PAM(Proto-spacer adjacent motif) 序列有關(guān)[13-14] ， Ⅱ型系統(tǒng)中 tracrRNA 也參與了 Cas9 的切割[15] 等等。

 

 

 

CRISPR/Cas 系統(tǒng)廣泛分布于 90% 的古細(xì)菌 及 50% 的細(xì)菌基因組或質(zhì)粒上[16]。它由 CRISPR 基因座和 Cas 基因 2 部分組成，其中，CRISPR 基因 座又包括位于 CRISPR 基因座上游富含 AT 堿基的 前導(dǎo)序列 (Leader)、涵蓋回文序列的 20~50 bp 的重 復(fù)序列 (Repeat) 和從外源捕獲的間隔序列 (Spacer)。CRISPR/Cas 系統(tǒng)的免疫過程分為 3 個(gè)階段[17] ：1) 外 源 DNA 首次入侵時(shí)，細(xì)菌進(jìn)入適應(yīng)階段，來源于噬 菌體或質(zhì)粒上的前間隔序列 (Protospacer) 的 DNA 同源短片段被整合到 CRISPR 基因座前導(dǎo)序列下游 中，形成新的間隔序列；2) 外源 DNA 再次入侵時(shí)， 細(xì)菌激活了表達(dá)階段，CRISPR 基因座轉(zhuǎn)錄出前體 crRNA，由內(nèi)切核糖核酸酶催化加工成成熟的 crRNA；3) 在干擾階段，成熟的 crRNA 引導(dǎo) Cas 蛋 白復(fù)合物靶向噬菌體前間隔序列位置，識(shí)別噬菌體 基因組內(nèi)的 PAM 序列，對(duì)外源靶標(biāo)位置精準(zhǔn)切割 從而避免細(xì)菌切割自身 CRISPR 基因座。

 

 

 

2012 年，Jinek 等[15] 在《Science》上發(fā)表研究成 果，證明了crRNAs(CRISPR RNAs) 與反式作用 crRNA(Trans-activating crRNA，tracrRNA) 配對(duì)結(jié)合后形成雙分子的 RNA 結(jié)構(gòu)，可以介導(dǎo) Cas9 蛋白定 向切割 DNA 序列。2013 年，張峰團(tuán)隊(duì)率先利用 CRISPR/Cas9 技術(shù)在人類和小鼠細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)了精準(zhǔn) 的基因編輯，并構(gòu)建了可同時(shí)靶向多個(gè)位點(diǎn)的基因 編輯系統(tǒng)[18]。此后，CRISPR/Cas 基因編輯技術(shù)蓬勃發(fā)展。

 

 

 

Makarov 等[17, 19] 根據(jù) Cas 基因的數(shù)目和功能 將 CRISPR/Cas 系統(tǒng)分為了 2 大類 5 種類型 (Ⅰ~Ⅴ)16 種亞型，其中，Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型屬于第 1 類，它們?cè)?干擾靶基因時(shí)需要多個(gè) Cas 蛋白形成復(fù)合物協(xié)同 工作；Ⅱ和Ⅴ型屬于第 2 類，它們利用單一 Cas 蛋白就能夠干擾靶基因。第 2 類Ⅱ型系統(tǒng)較為簡單，研究也更加透徹，目前應(yīng)用較廣的 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)為Ⅱ型 CRISPR 系統(tǒng)，而新興的 CRISPR/Cas12a (Cpf1) 系統(tǒng)屬于Ⅴ型 CRISPR 系統(tǒng)。Shmakov 等[20] 2015 年又發(fā)現(xiàn)了Ⅵ和Ⅴ型的 2 種亞型。

 

 

 

2 CRISPR 基因編輯系統(tǒng)的建立 

 

 

 

在對(duì)細(xì)菌的 CRISPR/Cas 免疫系統(tǒng)及作用機(jī)理有了較深的認(rèn)識(shí)后，科學(xué)家們開始對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行改 造并應(yīng)用于動(dòng)植物的基因組編輯。目前應(yīng)用最廣泛 的 CRISPR 基因編輯系統(tǒng)主要包括 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)和 CRISPR/Cas12a 系統(tǒng)。 

 

 

 

2.1 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的建立 

 

 

 

CRISPR/Cas9 是目前報(bào)道的唯一被優(yōu)先應(yīng)用于基因編輯的Ⅱ型系統(tǒng)。與Ⅰ和Ⅲ型 CRISPR 系統(tǒng)需 要多個(gè) Cas 蛋白形成復(fù)合物共同發(fā)揮功能的機(jī)制不同，Ⅱ型 CRISPR 系統(tǒng)僅需 1 個(gè) Cas 蛋白和 2 個(gè) RNA 元件即可實(shí)現(xiàn)對(duì)靶 DNA 的切割[15]。為了進(jìn)一 步簡化 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，研究者通過保留必需元件 tracrRNA 和 crRNA 的核心序列并引入連接區(qū)， 將兩者合并為一個(gè) sgRNA(Single guide RNA)，并通過體外試驗(yàn)證實(shí) Cas9 蛋白能在 sgRNA 的引導(dǎo)下切割雙鏈 DNA，這一系列成果為 CRISPR/Cas9 在基因編輯中的廣泛應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。自 2013 年起，利用 CRISPR/Cas9 技術(shù)相繼實(shí)現(xiàn)了對(duì)人類細(xì) 胞、小鼠細(xì)胞、斑馬魚、果蠅、水稻、擬南芥等真核系統(tǒng)中的內(nèi)源基因組編輯[21-30]。

 

 

 

CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)主要包括兩大核心內(nèi)容：1) 構(gòu)建 Cas9/sgRNA 表達(dá)載體，將載體導(dǎo)入受 體細(xì)胞表達(dá)發(fā)揮編輯作用；2) 將表達(dá)純化的 Cas9 蛋白與合成的 sgRNA 導(dǎo)入受體細(xì)胞發(fā)揮編輯作用。來源于鏈球菌 Streptococcus pyogenes 的 Cas9 蛋白 SpCas9 最先被應(yīng)用于基因編輯，該蛋白含有一個(gè) RuvC-like 結(jié)構(gòu)域和一個(gè) HNH 核酸酶結(jié)構(gòu)域，兩者分別在靶 DNA 的 PAM 序列“NGG” 上游 3 nt 處對(duì) DNA 雙鏈進(jìn)行切割，形成平末端。在真核系統(tǒng)中，需要在 Cas9 蛋白中添加一段核定位信號(hào)以保證該蛋白進(jìn)入細(xì)胞核正常發(fā)揮功能。sgRNA 是一段具有特定結(jié)構(gòu)的單鏈 RNA，其 5＇端 約 2 0 個(gè)堿基與靶 D N A 互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，引導(dǎo) Cas9/sgRNA 復(fù)合物對(duì)相應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行切割，決定編輯位點(diǎn)特異性。因此，在構(gòu)建 Cas9/sgRNA 表達(dá)載體編輯受體基因組中不同的位點(diǎn)時(shí)，只須改變 sgRNA 中 5＇端的特異位點(diǎn)識(shí)別序列，而其他元件可保持不變，極大地降低了載體構(gòu)建的技術(shù)門檻。此外，通過構(gòu)建多個(gè) sgRNA 表達(dá)盒的串聯(lián)載體，可 實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)多個(gè)靶位點(diǎn)的有效編輯，顯著地提高了該系統(tǒng)的編輯效率。在 Cas9/sgRNA 表達(dá)載體構(gòu)建完成后，需要通過多種轉(zhuǎn)化手段將表達(dá)元件或 Cas9/sgRNA 產(chǎn)物導(dǎo)入到編輯受體中發(fā)揮功能。在植物系統(tǒng)中，將 Cas9/sgRNA表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞的有效方法包括原生質(zhì)體PEG 轉(zhuǎn)染、農(nóng)桿菌葉片注射法、基因槍轟擊、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化等，不同方法在不同植物中的編輯效率各異[31-33]。在此基礎(chǔ)上， 不同實(shí)驗(yàn)室針對(duì)植物系統(tǒng)影響編輯效率的關(guān)鍵因素如 sgRNA 序列、啟動(dòng)子選擇、Cas9 變體或同源蛋白的選擇等進(jìn)行了一系列探索和優(yōu)化[31, 33-35]。

 

 

 

2.2 CRISPR/Cas12a 系統(tǒng)的建立 

 

 

 

雖然 CRISPR/Cas9 被廣泛應(yīng)用，但該系統(tǒng)仍存 在編輯位點(diǎn)受限、脫靶情況較多等缺陷，因此開發(fā) 與建立新的 CRISPR 基因編輯系統(tǒng)是科學(xué)家們研究 的熱點(diǎn)之一。CRISPR/Cas12a 屬于Ⅴ型 CRISPR/ Cas 系統(tǒng)，它同樣只需一個(gè) Cas 蛋白即可對(duì)雙鏈 DNA 進(jìn)行切割，但其作用元件和作用模式與 CRISPR/ Cas9 截然不同[36]。首先，僅攜帶 RuvC-like 結(jié)構(gòu)域的 Cas12a 在 crRNA 引導(dǎo)下即可切割雙鏈 DNA，不 需要 tracrRNA 的參與；其次，C12a 特異識(shí)別富含 T 的 PAM 序列；最后，Cas12a 在靶 DNA 的 PAM 序列下游 18 nt 處 (正鏈) 和 23 nt 處 (負(fù)鏈) 對(duì) DNA 雙鏈進(jìn)行切割，形成黏性末端。與 CRISPR/Cas9 相 比，該系統(tǒng)具有如下獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[ 3 7 - 3 8 ] ：1)CRISPR/ Cas12a 系統(tǒng)的 crRNA 比 sgRNA 更短，且 Cas12a 蛋白也比 Cas9 蛋白更小，因此，CRISPR/Cas12a 適用于更多裝載量小的載體系統(tǒng)，特別是多靶點(diǎn)編輯 的情況；2)Cas12a 切割 DNA 后形成黏性末端，增 加了HDR 修復(fù)途徑發(fā)生的概率，有利于 DNA 片段 的定點(diǎn)插入和替換；3) 在多個(gè)物種的基因編輯中， CRISPR/Cas12a 表現(xiàn)出更低的脫靶率。

 

 

 

目前，CRISPR/Cas12a 在基因編輯中的應(yīng)用仍局限于少數(shù)物種，植物的研究大部分集中在水稻系 統(tǒng)[39-46] 以及少數(shù)煙草、擬南芥、大豆和玉米等系統(tǒng) 的報(bào)道[39, 42, 46-47]。這可能是因?yàn)?CRISPR/Cas12a 在 低溫條件下編輯效率低[46] ，且較嚴(yán)格的 PAM 序列 “TTTV”降低了該系統(tǒng)的編輯范圍?；谄渥陨淼?優(yōu)點(diǎn)及局限性，CRISPR/Cas12a 成為了繼 CRISPR/Cas9 后第 2 個(gè)被廣泛關(guān)注的基因編輯系統(tǒng)，兩者互為補(bǔ) 充，進(jìn)一步豐富了基因組編輯系統(tǒng)選擇的多樣性。

 

 

 

3 CRISPR/Cas9 在植物基因組編輯中的應(yīng)用

 

 

 

目前 CRISPR/Cas9 在植物基因組編輯中的應(yīng)用主要包括基因功能研究和作物遺傳改良，編輯形 式可分為功能基因的敲除、基因 (片段) 的定點(diǎn)插入或替換、單堿基編輯和基因表達(dá)調(diào)控 4 個(gè)方面。 

 

 

 

3.1 功能基因的敲除

 

 

 

 利用 CRISPR/Cas9 對(duì)功能基因進(jìn)行特異敲除是目前該系統(tǒng)在植物中應(yīng)用最廣泛的方向。這是由 于 Cas9 蛋白切割目標(biāo) DNA 形成雙鏈斷裂后，往往會(huì)優(yōu)先啟動(dòng)編輯受體中的 NHEJ 易錯(cuò)修復(fù)途徑，大 多數(shù)情況下可以在切割位點(diǎn)附近產(chǎn)生堿基并插入缺失 (Indel)，且大部分是 1 bp 的插入、小部分為短 片段缺失[48-49]。當(dāng)產(chǎn)生的 Indel 位于基因外顯子且 堿基數(shù)不是 3 的倍數(shù)時(shí)，便會(huì)造成密碼子的移碼突 變。對(duì)于二倍體植物如水稻，由 CRISPR/Cas9 產(chǎn)生 、突變的效率能達(dá)到 80% 以上[50]。當(dāng) 2 個(gè)等位基因 同時(shí)被編輯產(chǎn)生雙等位突變或純合突變時(shí)，便能實(shí)現(xiàn)基因的敲除。對(duì)于多倍體植物，所有等位基因同 、時(shí)被編輯的概率偏低，因此多倍體植物特別是小麥、土豆等農(nóng)作物的高效編輯體系構(gòu)建仍是當(dāng)前研 究的難點(diǎn)[51-52]。

 

 

 

基于 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)介導(dǎo)基因敲除的高效性，多基因編輯技術(shù)隨即誕生。多基因編輯主要有 2 條途徑：1) 對(duì)多個(gè)同源基因同時(shí)進(jìn)行敲除，此時(shí)只需以它們的保守序列作為靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)一條 sgRNA 即可敲除多個(gè)基因，但該方法使用范圍受限；2) 對(duì)不 同基因設(shè)計(jì)針對(duì)不同靶點(diǎn)的 sgRNA，將多個(gè) sgRNA 表達(dá)盒連接到表達(dá)載體并導(dǎo)入編輯受體，如在水稻 中能實(shí)現(xiàn) 7 個(gè)基因的同時(shí)敲除[49]。這種多靶點(diǎn)編輯 技術(shù)特別適用于功能冗余基因、基因家族和同一生 化途徑中多個(gè)基因的功能研究，以及農(nóng)作物中多個(gè) 農(nóng)藝性狀的改良。此外，多靶點(diǎn)編輯技術(shù)還能通過在 基因片段兩側(cè)各設(shè)計(jì)一個(gè)靶點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)片段的刪除。目 前利用該方法可成功刪除大于 100 kb 的染色體片段，而對(duì)于 1 kb 以內(nèi) (特別是<100 bp)的小片段則擁 有較高的刪除效率[53-55]。片段刪除法可以對(duì)基因進(jìn) 行更徹底的敲除，特別是針對(duì)非編碼基因，也可用于特定結(jié)構(gòu)域的功能分析。已有大量研究通過對(duì)水稻的已知基因進(jìn)行 CRISPR 編輯敲除從而快速獲得具有高抗、高產(chǎn)、高品質(zhì)等優(yōu)良性狀的植株 (表 1)。

 

 

 

3.2 基因 (片段) 的定點(diǎn)插入或替換 

 

 

 

當(dāng)利用 CRISPR/Cas9 引入 DNA 雙鏈斷裂的同 時(shí)引入一個(gè)供體片段，且該片段的兩端攜帶與 DNA 斷裂處相似的序列，此時(shí)編輯受體有一定的概率會(huì) 啟動(dòng) HR 修復(fù)途徑，通過同源重組實(shí)現(xiàn)供體片段的 精確插入或替換。與 NHEJ 途徑造成的隨機(jī)插入或 缺失相比，該編輯方式更加精準(zhǔn)靈活，可實(shí)現(xiàn)多個(gè) 控制優(yōu)良性狀基因的穩(wěn)定聚合，解決傳統(tǒng)育種中優(yōu) 良性狀無法連鎖遺傳的問題，因此具有更廣泛的應(yīng) 用前景。雖然自 CRISPR/Cas9 技術(shù)誕生以來，已在 煙草、擬南芥、水稻、大豆、玉米等植物中實(shí)現(xiàn)基因 片段的精準(zhǔn)插入或替換，但這些案例的編輯目標(biāo)基 因往往就是抗性基因，依賴于使用篩選劑富集編輯 細(xì)胞，編輯效率低[75]。

 

 

 

為了提高編輯效率，科學(xué)家們采取不同的方式 對(duì)該技術(shù)進(jìn)行改良。鑒于 HR 修復(fù)途徑的低效性， 有研究通過在相鄰的內(nèi)含子中分別設(shè)計(jì)一個(gè)靶位點(diǎn)，利用相對(duì)高效的 NHEJ 途徑實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)插 入和替換，而內(nèi)含子中插入連接點(diǎn)的堿基變異不會(huì)影響所在基因的功能[72]。另外，由于供體片段向編 輯受體的傳遞不到位是影響 HR 途徑編輯效率的主 要原因之一，有研究利用雙生病毒系統(tǒng)作為供體片段的載體，通過復(fù)制出大量供體片段拷貝，從而提 高插入編輯效率[76]。然而，這些系統(tǒng)大多數(shù)仍需要 使用額外的抗性標(biāo)記提高編輯效率。為了尋求更理 想的技術(shù)體系，有研究者提出一種不依賴抗性標(biāo)記 的連續(xù)轉(zhuǎn)化方法，該方法通過在母細(xì)胞系中利用卵 細(xì)胞來源的早期胚胎特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng) Cas9 的表 達(dá)，提高擬南芥中同源重組介導(dǎo)的基因插入和替換 的概率[77]。

 

 

 

3.3 單堿基編輯 

 

 

 

目前的單堿基編輯技術(shù)是指對(duì)目標(biāo)基因片段 中的特定位點(diǎn)的單個(gè)堿基進(jìn)行轉(zhuǎn)換。該技術(shù)的建立 最早依賴于胞嘧啶脫氨酶的使用[7 8] ，其作用機(jī)理 是將胞嘧啶脫氨酶和人工突變后的 DNA 切口酶 nCas9 進(jìn)行融合，融合蛋白在 sgRNA 的引導(dǎo)下將靶 點(diǎn) PAM 序列上游約 5~12 堿基范圍內(nèi)非靶標(biāo)鏈上 的胞嘧啶 (C) 轉(zhuǎn)換為尿嘧啶 (U)，同時(shí)切割靶標(biāo)鏈 產(chǎn)生單鏈斷裂，此時(shí)編輯受體啟動(dòng)修復(fù)機(jī)制，以非 靶標(biāo)鏈為模板將互補(bǔ)鏈中的鳥嘌呤 (G) 替換為腺嘌 呤 (A)，最終實(shí)現(xiàn) C/G 到 T/A 的轉(zhuǎn)換，該系統(tǒng)因而 被稱為胞嘧啶編輯器 (CBE)。此外，尿嘧啶糖基化 酶抑制蛋白 (UGI) 的使用可提高 DNA 中尿嘧啶的 穩(wěn)定性，從而使編輯效率高達(dá) 75%[78]。另一項(xiàng)研究 通過定向進(jìn)化法在大腸埃希菌中獲得一個(gè)突變型的腺苷脫氨酶，可將 DNA 中的腺嘌呤轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤 (I)，后者在 DNA 復(fù)制過程中可被識(shí)別為鳥嘌呤[79]。將腺苷脫氨酶與 nCas9 進(jìn)行融合，即可通過類似于 CBE 的機(jī)制實(shí)現(xiàn)靶序列中 A/T 到 G/C 的轉(zhuǎn)換，該系統(tǒng)被稱為腺嘌呤編輯器 (ABE)。CBE 和 ABE 系統(tǒng)的建立使單堿基編輯能實(shí)現(xiàn) 4 種形式的堿基轉(zhuǎn)換，該系統(tǒng)不依賴于 DNA 雙鏈斷裂的產(chǎn)生， 既規(guī)避了 NHEJ 修復(fù)途徑的隨機(jī)性，也擺脫了 HR 修復(fù)途徑效率低的限制。

 

 

 

目前，已有多篇報(bào)道分別將 CBE 和 ABE 系統(tǒng) 加以改造并應(yīng)用在水稻、小麥、玉米、番茄、擬南芥等植物中[73-74, 80-86] ，且以水稻的研究居多。這些研究表明，同一編輯系統(tǒng)對(duì)不同靶點(diǎn)的編輯效率差異較大[73-74] ，而造成這種差異的具體原因仍需進(jìn)一步研究。此外，利用基于胞嘧啶脫氨酶 APOBEC1 的 CBE 系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯時(shí)，該酶對(duì)編輯位點(diǎn)具有偏好性，僅對(duì)序列為 TC 中的 C 有較強(qiáng)的編輯效率[74,87]。因此，有研究者提出用 hAID 替代 APOBEC1[87] ， 前者偏向于對(duì) GC 或 AC 中的 C 進(jìn)行編輯，該系統(tǒng)與 APOBEC1 系統(tǒng)互為補(bǔ)充，提高了 CBE 編輯的適用性。

 

 

 

3.4 基因的表達(dá)調(diào)控 

 

 

 

對(duì)于生長發(fā)育必需基因，徹底敲除往往會(huì)造成 植株死亡從而無法獲得敲除體，因此需要通過調(diào)控 表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)的功能研究。目前提高基因在植物 中的表達(dá)主要依賴于外源基因的插入，但該技術(shù)無 法控制基因插入位點(diǎn)和拷貝數(shù)，從而導(dǎo)致表達(dá)水平 不穩(wěn)定，且進(jìn)行多基因插入時(shí)載體構(gòu)建過程繁瑣。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，重要農(nóng)藝性狀往往由數(shù)量性狀基因 座 (QTL) 控制，而傳統(tǒng)育種常需要耗費(fèi)大量精力對(duì) 啟動(dòng)子中攜帶有利變異的 QTL 進(jìn)行篩選與利用。因此，通過 CRISPR/Cas 等技術(shù)實(shí)現(xiàn)植物體內(nèi)源基 因精確、高效的表達(dá)調(diào)控是理論研究和生產(chǎn)實(shí)踐的迫切需求。

 

 

 

目前，利用 CRISPR/Cas9 調(diào)控植物基因表達(dá)主要有 2 種途徑。一種途徑是用 Cas9 蛋白對(duì)目標(biāo)基 因的啟動(dòng)子區(qū)的順式調(diào)控元件 (CRE) 進(jìn)行編輯或 直接刪除，改變基因的表達(dá)水平或模式[88]。該方法 的代表性研究為 Rodriguez-Leal 等[89] 通過對(duì)番茄中 多個(gè)基因 CRE 的編輯獲得了人工的 QTL 變異，實(shí) 現(xiàn)了果實(shí)大小等重要農(nóng)藝性狀的精準(zhǔn)調(diào)控。該方法 可通過后代分離獲得不帶轉(zhuǎn)基因的編輯個(gè)體，但也 存在隨機(jī)性高、未必能獲得理想性狀等缺陷。另一 種途徑是將人工突變后失去核酸酶活性、卻仍保留 DNA 結(jié)合能力的 dCas9 蛋白與特定的轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域融合，通過 sgRNA 將融合蛋白帶到目標(biāo)基因 的啟動(dòng)子區(qū)，抑制或激活該基因的表達(dá)[90]。目前該 方法已成功應(yīng)用在擬南芥、煙草和水稻中[91-93]。此 外，dCas9 還能通過融合乙酰轉(zhuǎn)移酶等蛋白實(shí)現(xiàn)表 觀遺傳編輯，從而調(diào)控基因表達(dá)[90] ，但植物中相關(guān) 研究鮮見報(bào)道。

 

 

 

4 CRISPR 基因編輯靶點(diǎn)的分析技術(shù) 

 

 

 

CRISPR/Cas 系統(tǒng)對(duì)植物基因組的編輯簡單易行、成本低、突變率高，能實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因同時(shí)編輯， 是生物技術(shù)的重大突破，它的應(yīng)用使得基因功能研究和作物遺傳改良等領(lǐng)域飛速發(fā)展。利用 CRISPR/ Cas 系統(tǒng)在植物中進(jìn)行基因編輯后，植株將產(chǎn)生不同類型的突變。為了更好地解析編輯后植株的突變類型，科研工作者開發(fā)了以下 3 種基于不同原理的 靶點(diǎn)分析技術(shù)。

 

 

 

4.1 基于 Sanger 測(cè)序的靶點(diǎn)分析技術(shù)

 

 

 

利用 CRISPR/Cas 系統(tǒng)對(duì)二倍體植物基因編輯后，植株多產(chǎn)生簡單突變，如純合突變、雙等位突變和雜合突變[49]?；?Sanger 測(cè)序的靶點(diǎn)分析技術(shù)主要適合于簡單突變的樣品。Ma 等[49] 利用植物密 碼子優(yōu)化 Cas9 基因，構(gòu)建了一個(gè)高效、強(qiáng)大的多靶 點(diǎn) CRISPR/Cas9 基因編輯載體系統(tǒng)，可以方便快捷地實(shí)現(xiàn)對(duì)單子葉植物和雙子葉植物的多重基因組編輯，編輯效率高達(dá) 85.4%。為了獲知靶點(diǎn)的突變情況，經(jīng)典的解碼方法是利用特異引物將包含靶點(diǎn)序列的 DNA 片段擴(kuò)增下來，構(gòu)建克隆，并挑取多個(gè)克隆進(jìn)行 Sanger 測(cè)序。但這種方法花費(fèi)高、耗時(shí)長，在編輯植株較多時(shí)工作強(qiáng)度大。如果直接將 PCR 產(chǎn)物測(cè)序，純合突變株在基因組內(nèi)發(fā)生的具體突變 (缺失、插入或替換) 可以通過野生型序列和突變株序列比對(duì)獲知；但當(dāng)突變類型為雙等位突變和雜合突變時(shí)，測(cè)序峰圖便會(huì)從突變位點(diǎn)起延續(xù)雜亂的雙峰[94]。

 

 

 

Ma 等[94] 開發(fā)了一種高效、簡單且能快速解碼 來自于雜合突變或雙等位突變的 PCR 產(chǎn)物測(cè)序雙峰信息的方法，叫簡并序列解碼 DSD(Degenerate sequence decoding)。其工作原理是：1) 測(cè)序峰圖中， 以第 1 個(gè)雙峰處為起點(diǎn)，標(biāo)注 10~12 bp 的簡并序 列 DS(Degenerate sequence)，雙峰上游 8~10 bp 為 錨定序列 AS(Anchor sequence)；2) 將 DS 與野生型序列進(jìn)行比對(duì)搜索，獲得匹配；3) 將簡并匹配得到的序列與 AS 鏈接，獲得等位鏈 1 的突變情況，利用簡并減法獲得等位鏈 2 的突變情況[94-95]。

 

 

 

DSD 方法簡單可靠，但若需要解碼數(shù)量更多的突變序列，手動(dòng)解碼還是較費(fèi)時(shí)。為了更高效率、更人性化地解決這個(gè)問題，Liu 等[95] 以 DSD 方法為原理編寫程序，開發(fā)了一個(gè)基于網(wǎng)頁的、多功能的對(duì) 包含靶位點(diǎn) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序文件直接解碼，輸出突變類型的網(wǎng)頁版解碼工具 DSDecode，可解碼純合突變、雙等位突變、雜合突變等。為了更快地同時(shí)處理大量測(cè)序文件，Xie 等[9 6] 將該軟件升級(jí)至 DSDecodeM (http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/)，可以同時(shí)解碼多個(gè)測(cè)序文件；更方便的是，該團(tuán)隊(duì)開發(fā)的一站式基因編輯軟件工具包 CRISPR-GE (http:// skl.scau.edu.cn)，可將 CRISPR/Cas9/Cas12a 的靶點(diǎn) 選擇、脫靶預(yù)測(cè)、載體構(gòu)建引物設(shè)計(jì)和對(duì)突變靶點(diǎn) 測(cè)序分析解碼一體化，使植物基因組編輯的工作更 加自動(dòng)化、人性化和高效可靠。

 

 

 

4.2 基于高通量測(cè)序的靶點(diǎn)分析技術(shù) 

 

 

 

當(dāng)植株的突變類型復(fù)雜，包括簡單突變和嵌合 突變 (一個(gè)靶點(diǎn)產(chǎn)生的突變多于 2 種)、或者需要解 析多倍體物種的基因組編輯、或者一次性測(cè)大量的靶點(diǎn)突變事件時(shí)，基于 Sanger 測(cè)序的靶點(diǎn)分析技術(shù)便不太適用了，此時(shí)基于高通量二代測(cè)序 NGS (Next generation sequencing) 的靶點(diǎn)分析技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。已開發(fā)的高通量測(cè)序分析靶點(diǎn)技術(shù)包括 AGEseq、Cas-analyzer、CRISPR-GA、CRISPResso 和 Hi-TOM 等。

 

 

 

Xue 等[97] 開發(fā)的 AGEseq 是第一個(gè)支持高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的基因編輯分析平臺(tái)，它同時(shí)也支持 Sanger 測(cè)序數(shù)據(jù)，是基于 Galaxy 的網(wǎng)頁工具，若需處理大量數(shù)據(jù)，可以下載獨(dú)立的軟件程序。Park 等[98] 開發(fā)的 Cas-Analyzer 是一個(gè)基于 JavaScript 的 NGS 數(shù)據(jù)分析平臺(tái)，支持各種可編程核酸酶誘 導(dǎo)的突變頻率分析，包括單核酸酶和配對(duì)核酸酶， 如 ZEN、TALENs、CRISPR/Cas9 以及 CRISPR/ Cpf1 系統(tǒng)等。由于 Cas-Analyzer 是完全在客戶端 Web 瀏覽器中即時(shí)使用，無需將龐大的 NGS 數(shù)據(jù) 集上傳到服務(wù)器，支持上傳壓縮文件，節(jié)省了時(shí) 間[98]。Güell 等[99] 開發(fā)的 CRISPR-GA 是簡易評(píng)估 基因編輯質(zhì)量的平臺(tái)，評(píng)估過程只需要點(diǎn)擊 3 次鼠 標(biāo)。它用于評(píng)估二代測(cè)序數(shù)據(jù)并量化編輯效果，如 對(duì)在編輯位置發(fā)生插入、刪除或同源重組的數(shù)量、 比例以及對(duì)不同突變類型的檢測(cè)分析，并能夠生成 一個(gè)報(bào)告。Pinello 等[100] 開發(fā)的 CRISPResso 可以 準(zhǔn)確定量和可視化 CRISPR-Cas9 結(jié)果，并對(duì)編碼序 列、非編碼元件和選定脫靶位點(diǎn)的影響進(jìn)行綜合評(píng) 估，可用于定性和定量評(píng)估基因組編輯結(jié)果，以及 標(biāo)準(zhǔn)化和簡化目前需要開發(fā)自定義內(nèi)部算法的分析。Liu 等[101] 開發(fā)的 Hi-TOM 可用于多個(gè)樣品和多 個(gè)靶位點(diǎn)的突變鑒定，可獲得精確的百分比數(shù)據(jù)。搭橋序列和 Barcode 引物的引入大大提升了 HiTOM 可同時(shí)檢測(cè)的樣品通量，簡化的 NGS 文庫構(gòu) 建和綜合結(jié)果輸出使 Hi-TOM 特別適用于由 CRISPR/Cas 系統(tǒng)誘導(dǎo)的所有類型突變的高通量鑒 定，尤其是復(fù)雜基因組編輯或復(fù)雜嵌合突變，具有 高可靠性和靈敏度。

 

 

 

4.3 基于非測(cè)序手段的靶點(diǎn)分析方法 

 

 

 

上述 2 種基于測(cè)序數(shù)據(jù)的靶點(diǎn)分析方法的優(yōu) 勢(shì)在于可以直觀地獲取突變的具體信息，包括突變 位點(diǎn)、類型及等位鏈上變化的堿基數(shù)。

 

 

 

基于非測(cè)序手段的靶點(diǎn)分析方法包括 PCRRE(PCR/restriction enzyme) 法、T7E1(T7 endonuclease I) 法和 HRM(High-resolution melting assay) 法等，這 些方法無需獲知具體的堿基變異序列就能簡易地 辨別基因編輯是否成功。如果設(shè)計(jì)得當(dāng)，可以使限 制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)落在靶點(diǎn)位置上，若 CRISPR/ Cas 系統(tǒng)功能產(chǎn)生了突變，限制性酶切位點(diǎn)也遭到 了破壞，酶切基因組 DNA 后可用 PCR 擴(kuò)增確認(rèn)， 這就是 PCR-RE 法[102-103]。PCR-RE 法要求靶點(diǎn)處有 酶切位點(diǎn)，這大大限制了靶位點(diǎn)的選擇。利用特異 切割錯(cuò)配分子的 T7EI 或 SURVEYOR 酶也可以檢 測(cè)突變情況，將來源于打靶樣品與野生型樣品的包 含靶序列區(qū)段的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物混合后，變性再復(fù) 性，使突變序列與野生型序列產(chǎn)生錯(cuò)配分子，用 T7E1 切割后電泳檢測(cè)[104]。此方法同樣可以用于檢 測(cè)突變的靶位點(diǎn)及計(jì)算突變效率，檢測(cè)靈敏度較 PCR-RE 法低，但沒有靶序列的限制[103]。HRM 法是 利用突變后序列與野生型序列的熔解曲線不同篩 選突變株，同時(shí)利用單鏈突變片段的構(gòu)象改變、以 及在非變形 PAGE 膠上隨之改變的遷移率來鑒定 突變分子的方法[105]。

 

 

 

5 基因編輯技術(shù)的脫靶風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

 

 

 

脫靶效應(yīng)是指在基因編輯過程中，CRISPR 系 統(tǒng)對(duì)非靶標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行非特異編輯從而導(dǎo)致不可控 的基因組變異。由于編輯特異性是決定 CRISPR 系 統(tǒng)應(yīng)用前景的重要因素，自該技術(shù)誕生以來已有大 量的研究對(duì)其脫靶效應(yīng)進(jìn)行了分析，并發(fā)現(xiàn)編輯細(xì) 胞中確實(shí)存在脫靶現(xiàn)象，且脫靶情況的出現(xiàn)與靶序 列的特異性有關(guān)[29, 106]。為了更全面地分析 CRISPR 基因編輯個(gè)體的脫靶情況，多項(xiàng)研究利用全基因組 測(cè)序分別檢測(cè)了小鼠和大鼠[107] 、水稻[108-109] 、番茄[110] 、 棉花[111] 等 CRISPR 編輯動(dòng)植物的全基因組脫靶情 況，發(fā)現(xiàn)由 Cas 蛋白/sgRNA 復(fù)合物引起的脫靶僅 在一些具有相似性的靶點(diǎn)中低概率發(fā)生，說明 Cas 蛋白介導(dǎo)的基于 NHEJ 途徑的編輯具有較高的特異 性。此外，單堿基編輯系統(tǒng)的特異性也是近年的研 究熱點(diǎn)?；诎奏っ摪泵富钚缘?CBE 系統(tǒng)在編 輯位點(diǎn)處容易產(chǎn)生 Indel 或其他非特異編輯[74, 80] ，而 類似情況并未出現(xiàn)在 ABE 編輯植物中[73, 84-85]。通過 全基因組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，CBE 編輯小鼠和水稻均存 在大范圍的脫靶效應(yīng)，且該脫靶現(xiàn)象與 Cas 蛋白的 活性及 sgRNA 的特異性無關(guān)[112-113]。表明 ABE 相 比于 CBE 具有較高的編輯特異性，同時(shí)也進(jìn)一步 證實(shí)了基于 Cas 蛋白和 sgRNA 復(fù)合物的基因編輯 具有較低的脫靶風(fēng)險(xiǎn)。

 

 

 

為了降低由 Cas 蛋白/sgRNA 復(fù)合體造成的脫 靶風(fēng)險(xiǎn)，研究者提出了多種解決途徑：1) 通過截短或優(yōu)化 sgRNA 結(jié)構(gòu)提高編輯特異性[114-116] ，但也有研究表明靶位點(diǎn)識(shí)別序列不完整的截短 型 sgRNA 會(huì)嚴(yán)重降低該系統(tǒng)在植物中的編輯效率[117] ；2) 在設(shè)計(jì)靶點(diǎn)時(shí)使用軟件 (如 CRISPR-GE[96] ) 分析 脫靶風(fēng)險(xiǎn)，挑選特異性高的靶點(diǎn)進(jìn)行編輯，并在編 輯后對(duì)潛在脫靶位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序分析；3) 降低編輯受 體內(nèi) Cas 蛋白/sgRNA 復(fù)合物的含量[116] 或直接將預(yù) 先合成的 Cas9/sgRNA 核酸蛋白復(fù)合體導(dǎo)入編輯受 體中[118-119] ；4) 將 Cas9 蛋白點(diǎn)突變?yōu)楹怂崆锌诿?，?用成對(duì)的切口酶分別在靶標(biāo)鏈和互補(bǔ)鏈中產(chǎn)生單 鏈斷裂[114-115] ；5) 通過結(jié)構(gòu)改造獲得特異性高且不影 響編輯效率的 Cas9 蛋白變體，如 eSpCas9[ 120 ] 、 SpCas9-HF1[121] 等。針對(duì)單堿基編輯系統(tǒng) CBE，其 大范圍脫靶的產(chǎn)生應(yīng)該是由胞嘧啶脫氨酶的活性 造成，因此該類脫靶情況無法通過提高 sgRNA 特 異性來避免，也許能通過人工改造降低脫氨酶活 性、降低胞嘧啶脫氨酶?UGI 復(fù)合物在編輯受體中 的積累量、或?qū)ふ姨禺愋愿叩男滦桶奏ぞ庉嬈?3 種途徑解決[122]。

 

 

 

雖然已有大量工作對(duì) CRISPR 進(jìn)行優(yōu)化并提高 其特異性，但目前仍無法完全避免編輯個(gè)體脫靶的 情況。因此，在利用 CRISPR 技術(shù) (特別是 CBE 系 統(tǒng)) 進(jìn)行基因編輯時(shí)，不能忽略潛在的脫靶風(fēng)險(xiǎn)。對(duì) 于基因功能研究，為了排除脫靶現(xiàn)象造成的結(jié)果誤判，應(yīng)對(duì)多個(gè)獨(dú)立編輯個(gè)體進(jìn)行基因型和表型的關(guān)聯(lián)分析，確定表型的變化是由目標(biāo)基因的突變引起 的。對(duì)于醫(yī)學(xué)治療領(lǐng)域，由于涉及到人類的健康和 倫理問題，CRISPR 技術(shù)的應(yīng)用須實(shí)現(xiàn)“零風(fēng)險(xiǎn)”，因此開發(fā)精準(zhǔn)高效的體內(nèi)全基因組脫靶檢測(cè)技術(shù)如 VIVO[123] 、DISCOVER-Seq[124] 等是推動(dòng) CRISPR 在該領(lǐng)域穩(wěn)健發(fā)展的重要手段。對(duì)于農(nóng)作物育種，盡 管脫靶也同樣會(huì)對(duì)農(nóng)作物造成正面或負(fù)面的影響， 但育種過程就是一個(gè)人工選擇性狀的過程，若脫靶造成了農(nóng)藝性狀的劣化，可通過對(duì)后代進(jìn)行分離性狀篩選去除脫靶個(gè)體；若脫靶產(chǎn)生了性狀的優(yōu)化， 則可將該脫靶位點(diǎn)保留并做進(jìn)一步研究。可見，脫 靶情況的存在基本不會(huì)阻礙 CRISPR 技術(shù)在基因功 能研究和農(nóng)作物育種中的應(yīng)用，而該技術(shù)在醫(yī)學(xué)治 療中的普及則有待脫靶檢測(cè)體系的進(jìn)一步優(yōu)化和 基因編輯特異性的進(jìn)一步提高。

 

 

 

6 展望

 

 

 

CRISPR 基因編輯技術(shù)由于操作過程簡便、編 輯效率高、支持多靶點(diǎn)編輯、編輯形式多樣等優(yōu)勢(shì)， 在短短幾年內(nèi)飛速發(fā)展，并在多種植物中得到廣泛 應(yīng)用，為基因功能研究及作物性狀改良做出了重要 貢獻(xiàn)。隨著越來越多的功能基因被克隆，該技術(shù)在 生產(chǎn)實(shí)踐上的應(yīng)用范圍將越來越廣。然而，該技術(shù) 仍存在一些不足之處：1) 脫靶效應(yīng)的存在，其潛在 的風(fēng)險(xiǎn)以及相應(yīng)解決手段已在前文詳細(xì)闡述。2) 由 于 Cas 蛋白的 PAM 序列相對(duì)固定，會(huì)出現(xiàn)部分基 因難以尋找合適編輯位點(diǎn)的情況。研究者們主要通 過 2 種途徑解決這一問題，其一是通過人工改造 Cas9 蛋白序列使其識(shí)別不同的 PAM 位點(diǎn)，其二是 在不同物種中尋找并鑒定更多的 Cas9 同源蛋白， 甚至是來源于不同免疫系統(tǒng)的其他 Cas 蛋白 (如 Cas12a)，從而擴(kuò)大 CRISPR 技術(shù)的應(yīng)用范圍[125]。3) 依賴 HR 同源修復(fù)的基因精準(zhǔn)編輯相比于其他編 輯形式具有更廣泛的應(yīng)用前景，雖然已有多項(xiàng)研究 致力于在植物中建立相應(yīng)編輯系統(tǒng)，但這些系統(tǒng)的 編輯效率仍遠(yuǎn)不及由 NHEJ 修復(fù)介導(dǎo)的易錯(cuò)編輯系 統(tǒng)，且尚未能在植物中推廣應(yīng)用。因此，仍需通過優(yōu) 化已有的系統(tǒng)或建立新的技術(shù)體系從而突破目前 的技術(shù)瓶頸。

 

 

 

隨著二代測(cè)序的發(fā)展，基因編輯技術(shù)基于高通 量測(cè)序手段的靶點(diǎn)分析技術(shù)有了堅(jiān)固的技術(shù)基石， 高通量大數(shù)據(jù)的獲取變得更平常、更方便，價(jià)格也 更親民。基因編輯技術(shù)的飛躍也使得植物基因功能 探究如虎添翼，科學(xué)家們也傾向于尋找更復(fù)雜物種 基因組內(nèi)隱藏的秘密。在接下來的數(shù)年間，CRISPR/ Cas 仍會(huì)作為主流基因編輯系統(tǒng)應(yīng)用于各物種的基 因功能探究以及植物遺傳性狀改良等領(lǐng)域。靶點(diǎn)分 析技術(shù)需向更高通量、更深層次、更快捷、更智能方 向發(fā)展，如果能搭上信號(hào)傳輸通路和人工智能發(fā)展 的快車，將會(huì)大大助力基礎(chǔ)科學(xué)研究。目前，基于二 代測(cè)序的基因編輯數(shù)據(jù)分析平臺(tái)的功能還不夠強(qiáng) 大，易用性不夠友好。劉耀光團(tuán)隊(duì)開發(fā)了基于二代 測(cè)序的更高通量、更加靈活易用的檢測(cè)軟 件 HiDecode，一次可以鑒定多達(dá) 96×96 個(gè)靶點(diǎn)的突變 樣品，每個(gè)突變體可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)不同靶點(diǎn) (未 發(fā)表)，大大省去了看樣本峰圖分辨突變情況的時(shí)間 和精力，讓研究更高效。

 

 

 

總之，基于 CRISPR 的植物基因組編輯技術(shù)體 系仍有諸多技術(shù)難點(diǎn)尚未攻克，發(fā)展更高效精準(zhǔn)的 基因編輯系統(tǒng)，優(yōu)化突變檢測(cè)技術(shù)仍是今后的努力 方向。