顯微注射需要一套精密的顯微操作設備，主要包括以下幾個組成：氮氣供給罐、顯微注射儀、顯微注射儀連接氮氣供給罐。用于對注射針內的溶液施加壓力脈沖，利用可調節(jié)氣壓脈沖將精確微量體積的樣品注射至胚胎體內。注射器和一個腳踏板相連，幫助實驗人員在雙手進行實驗的同時可以通過踩踏板激活壓力脈沖將實驗樣品注射入胚胎。顯微操縱器。用于注射針的精準位移控制，可以在顯微注射過程中對注射針的運動進行精密調節(jié)。體視顯微鏡。用于顯微注射時觀察整個實驗過程，可以在顯微注射過程中看到胚胎并對注射針所在的位置聚焦。

 

顯微注射系統(tǒng)的過程：

第一步：顯微注射樣品準備

注射樣品需提前準備，根據(jù)不同的實驗目的，注射樣品通常包括質粒 DNA、RNA，morpholino，蛋白多肽和化學藥物等。

1.DNA質粒樣品：質粒DNA需使用“去內毒素”的試劑盒提取。一般注射量為每枚胚胎20-150pg，多于200pg胚胎死亡率上升。

2.mRNA 樣品：一般注射量為每枚胚胎10-500pg，針對不同的mRNA樣品，需要摸索各自適宜的濃度。

3.Morpholino樣品：Morpholino由美國GeneTools公司提供，通常產品總量為300 nmol一瓶，約相當于2400μg，加入300μL滅過菌的去離子水，每管20μL分裝作為儲液在-20℃凍存保存。注射時取一管稀釋至0.5-6μg/μL左右。針對不同的morpholino，需摸索各自合適的濃度，以獲得理想的表型而不產生毒性效應為宜。使用新的morpholino時，必須慎重考量該morpholino的有效性和特異性。

第二步：顯微注射針準備

在顯微注射實驗前，需使用拉針儀拉制一定數(shù)量，針尖大小以及針尖角度適合的注射針。拉制好的針可以放置在10x10mm培養(yǎng)皿中，內部用雙面膠固定以防晃動。注射針最好提前一天準備，且不宜一次準備過多，避免長期存放使注射針沾染空氣中的灰塵顆粒引起針尖阻塞。

第三步胚胎注射槽模具制備

稱取1.5g瓊脂糖粉末溶于100 mL去離子水中，微波爐加熱至溶解，將約15mL瓊脂糖液倒入90 mm培養(yǎng)皿中。待其稍涼至手可觸摸但尚未開始凝固后，將平皿制備模具緩慢倒扣于瓊脂糖液面上。待其完全凝固后，先用尖鑷子或刀片沿著模具四邊劃一下，然后從其一側短邊向上拔出模具，即得到顯微注射用平皿。

第四步：胚胎準備

1.配魚。注射前一天，將成年雌、雄魚按照1:1或2:1的比例放置于配種缸中，用隔板隔開，蓋好蓋子。將配種缸放置在平時養(yǎng)殖魚房臺面上，讓斑馬魚保持正常作息。

2.親魚產卵。進行顯微注射實驗的早上，抽去配種缸中的隔板，雌、雄魚接觸，一般在十分鐘左右開始交配產卵。在具體實驗中，可以先抽取2缸魚的隔板，使其接觸產卵，隨后根據(jù)實驗進度再適時抽取其它缸的隔板，以保證所收集的魚卵都處于發(fā)育早期。在抽取隔板前，可先將內缸連同親魚置換到另一盛有干凈養(yǎng)殖水的外缸中，以促進親魚產卵并節(jié)省清潔胚胎的時間。

3.收集受精卵。親魚產卵后，用魚卵撈網收集魚卵，應盡量收集受精20分鐘內的魚卵，即對于同一缸親魚，兩次收集魚卵的時間間隔不得超過20分鐘，以保證顯微注射的目標胚胎都處于接近的發(fā)育階段，并在胚胎4細胞期前完成注射。將魚卵倒入裝有養(yǎng)殖水的培養(yǎng)皿中，吸走其中的雜質。然后用吸管將魚卵排列到顯微注射平皿的凹槽中，清除胚胎周圍多余的養(yǎng)殖水就可以用于注射了。

4.注射用胚胎的發(fā)育階段控制。胚胎在受精后1至2分鐘內卵膜將膨脹，之后10分鐘動物極膨起，細胞形態(tài)變得較為規(guī)整，此時可以開始注射。受精后45分鐘左右（標準培育溫度28.5℃下所需時間，可因實驗時室溫情況有所不同）發(fā)生第一次卵裂，受精后1小時發(fā)生第二次細胞分裂達到4細胞期。樣品通常在1至4細胞時期內進行注射。

第五步：斑馬魚胚胎顯微注射

1.開啟顯微注射儀。首先打開氮氣罐總閥，調節(jié)壓力至0-0.5 MPa之間。之后打開顯微注射儀開關，調節(jié)主操作面板上的注射壓力值到15-20 psi之間，調節(jié)脈沖時間至40-50ms 之間，調節(jié)負壓面板上的壓力值到0.5psi左右避免注射時回吸和樣品外流。之后在實驗過程中，還需根據(jù)破針的大小進行微調，直至合適的注射壓力和脈沖時間。不同廠家的顯微注射儀顯示方式和設置會略有不同，一般來講斑馬魚胚胎顯微注射注射壓力控制在15-25 psi之間，脈沖時間在30-60 ms之間。

2.上樣裝針。將拉制好的注射針用橡皮泥豎直固定，然后吸取1至3μL顯微注射樣品，逐滴地將注射樣品滴在注射針頂端，在注射針內芯引導下，樣品通過虹吸作用將匯聚于玻璃管針頭部分。

3.破針。將上好樣品的注射針插入持針器中固定，然后在體視鏡最高放大倍率下，用尖頭鑷子將注射針的前端夾斷。破針的步驟需配合下面的劑量調整逐漸進行，注射針尖太細則很難刺破卵膜，注射針尖太粗則會給胚胎造成比較大損傷。

4.注射劑量調整。將臺微尺放置到體視顯微鏡下，其上滴一滴礦物油，將注射針小心地伸入礦物油中，踩動踏板壓將一滴注射液送到礦物油中，并在油中形成比較完美的球型。通過觀察臺微尺顯示的液滴直徑，推算注射樣品的體積大小。注射體積與針尖大小、注射壓力、脈沖時間、溶液粘度和外部壓力有關，理想的注射劑量為胚胎體積的10%，一般為1nL，因此液滴直徑要控制在0.1至0.15 mm之間。注射劑量應控制在1.8nL以內，注射劑量過大體積會損傷胚胎，過小可能影響定量精確度和擴散的均勻程度。

5.注射。將待注射的胚胎放置到體視顯微鏡下，用低倍物鏡對準胚胎調焦，調節(jié)操作器輕輕的落下針尖，將注射針尖推入視野中心，通過顯微操縱器的微調調整注射針位置，直到清晰見到針尖為止。進一步調整顯微鏡焦距和注射針及胚胎的位置，使胚胎和注射針尖均達到最佳清晰程度。對于不同的樣品，顯微注射的操作要求各有不同。注射mRNA 或Morpholino樣品，應把樣品注射到動物極下方的卵黃區(qū)域內；注射DNA樣品，則常常需要注射針穿過卵黃，把樣品注射到動物極內。

①卵黃注射：卵黃注射是將樣品注射到卵黃中，細胞質的流動和擴散會將注射樣品帶入到動物極。推動操縱器，小心進針，使注射針針尖穿過卵殼和卵黃膜進入卵黃，迅速踩動腳踏開關將樣品注入胚胎，然后將針拔出。由于在注射樣品中加入了酚紅，所以可以看到樣品在胚胎中擴散流動。通過卵黃注射相對比較容易，胚胎存活率高，但是樣品需要時間擴散到細胞質中。

②動物極注射。由于動物極的膜相對比卵黃膜結構更加嚴謹，直接注射動物極會造成胚胎極大的損傷，所以首先調整胚胎的朝向，使胚胎的動物極朝向平皿底部。然后從卵黃處進針，穿過卵黃到達動物極，將注射樣品直接注射到動物極中，這個操作過程需要平穩(wěn)，避免晃動。動物極注射需要正確的胚胎定位和注射技術，相對耗時較長，胚胎死亡率也比注射入卵黃高，但是DNA樣品需注射入動物極才能高效率發(fā)揮作用。

第六步：注射胚胎的培養(yǎng)和觀察

1.胚胎養(yǎng)殖。注射結束后，用滴管吸取養(yǎng)殖水將胚胎沖洗至90mm平皿內，置入28.5℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待胚胎發(fā)育3至6小時后，在顯微鏡下挑出未受精的魚卵（一直處于1細胞期或者只發(fā)生假分裂）、死亡的胚胎（內部呈現(xiàn)白色絮狀）和發(fā)育畸形胚胎（視情況而定，取決于注射樣品）。為保證養(yǎng)殖系統(tǒng)的健康，挑揀出來的胚胎用胚胎消毒液消毒2次，再用胚胎養(yǎng)殖水沖洗干凈。消毒后的胚胎放置于含0.5mg/L亞甲基藍的胚胎養(yǎng)殖水中，并放置于28.5℃恒溫培養(yǎng)箱內靜水養(yǎng)殖，每日換水。

2.胚胎觀察。通過向1至4細胞期的斑馬魚胚胎中注射不同的DNA、RNA以及morpholino 等樣品，可以實現(xiàn)基因突變或轉基因品系的構建、短時間過表達目的蛋白或敲降目標基因表達等目的。對于不同的樣品，可根據(jù)實際情況和預期的表型，選擇基因型鑒定與表型觀察的時間?，F(xiàn)分別以注射質粒DNA pT2(myl7:eGFP)和pax6a基因mopholino為例，介紹顯微注射的結果和胚胎熒光及表型觀察。

為了便于觀察顯微注射的結果，首先對胚胎進行麻醉和固定。通常將發(fā)育至2dpf (day post fertilization)的斑馬魚胚胎脫膜后，浸泡于0.016%的Tricaine中進行麻醉。麻醉劑可以使魚類代謝減緩，減少對氧的需求量，從而方便進行實驗操作。待胚胎麻醉后， 將胚胎小心地嵌入4%的甲基纖維素中，固定位置避免移動，用毛細針將胚胎小心地調整到合適觀察的位置。

質粒pT2(myl7:eGFP)是心肌細胞特異性表達基因myosin light chain 7(myl7)啟動子調控綠色熒光蛋白(eGFP)在整個心臟肌肉細胞內表達，胚胎發(fā)育至2dpf時可以在心臟中看到特異表達綠色熒光蛋白。

三、顯微注射注意事項

顯微注射的操作過程中有許多細節(jié)影響實驗的成功率，需要特別關注，否則容易造成實驗失敗，主要包括以下幾方面。

1.注射針堵塞，主要原因是注射樣品有雜質。顯微注射的樣品種類多樣繁多，包括mRNA、DNA或蛋白質等，但是注射樣品中是否存在固體懸浮物等雜質是否純凈是關系到注射效率高低的重要因素之一。所有樣品使用前需要先離心，使可能存在的固體懸浮物沉淀到管底，取上清液做注射樣品，避免堵住針頭。如果發(fā)生堵塞，通常可通過輕夾針尖、增大輸出壓力得以緩解。如果不能解決，需更換新的注射針，重新上樣。

2.注射樣品量過大或過小，主要是破針針尖準備過程操作不當造成的。進行顯微注射時，如何準備好針尖破針是顯微注射成功和保證效率極其重要的因素。破針準備針尖時，將注射針尖一點點剪斷，不宜一次剪太多。注射針尖如果太粗，會導致樣品流量過多，且給受精卵造成過大的傷口，易于裂解；太細則導致針內樣品流出速率過慢，易堵塞針尖而使樣品無法順利流出，且難以刺穿卵膜，影響注射效率。

3.調節(jié)注射節(jié)氣壓不當。主要表現(xiàn)在測量液滴大小的時候，沒有調控至合適的正壓

和負壓。正壓過大會導致脈沖結束后多余樣品流入胚胎，而負壓過大會導致脈沖結束后樣品甚至胚胎內容液被吸出來。正確的做法是在測量液滴大小的時候，觀察液滴的穩(wěn)定性。壓力調節(jié)合適的時候，一個脈沖壓力產生的液滴不會在脈沖結束后持續(xù)擴大或者在慢慢縮小，而是在脈沖結束后輕松脫離針尖，在礦物油內形成穩(wěn)定不變的液滴。此外， 在注射進行中如需對壓力進行微調，壓力調節(jié)不宜變化太快，否則會造成注射量難以控制，導致胚胎內環(huán)境改變過快過大甚至脹破細胞。

4.顯微注射后胚胎死亡率過高，有多種可能的原因。

a.注射操作不熟練。注射完畢，慢慢抽出注射針，要一氣呵成，避免受精卵內物質隨著注射針抽出，造成受精卵的損傷及堵針。

b.樣品濃度過高也是胚胎死亡率高的一個常見因素。針對不同的樣品初次注射時， 可嘗試不同的濃度梯度，摸索條件，找到適宜實驗目的，且不產生過多毒性的注射樣品濃度。

c.后續(xù)養(yǎng)殖的不精細。注射后胚胎需要細心照顧，影響胚胎發(fā)育的外界因素主要有：水溫（28.5℃恒溫培養(yǎng)箱養(yǎng)殖）；水質（及時挑出死胚和雜質并每日換水）和養(yǎng)殖密度（對于直徑為90mm 的培養(yǎng)皿，胚胎養(yǎng)殖密度以不高于50顆/皿為宜）。