傳統(tǒng)手段依賴亞克隆產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因外源質(zhì)粒，對于生成復雜的DNA構(gòu)建體具有一定的局限性，其需要使用不同的II型限制性內(nèi)切酶切割和多次亞克隆連接，效率低且耗時長。為此，催生出了一系列克隆工具如Gateway、In-Fusion和Gibson等，雖然這些方法大大改進了克隆效率，但由于其自身的特點，很難形成一套系統(tǒng)的方法運用于轉(zhuǎn)基因外源質(zhì)粒的構(gòu)建，如引入的重組位點可能影響基因和蛋白功能；多輪PCR容易引入突變且這些突變只有在整個連接完成后才能檢測出來；線性化片段不利于長期保存和二次利用；難以連接同源性高的相似基因片段等。

  鑒于此，2022年12月24日，中國科學院重慶綠色智能技術(shù)研究院陳靜影副研究員與西南大學楊昀副教授課題組合作在Journal of Molecular Cell Biology上在線發(fā)表了題為“GoldenFish: a rapid and efficient system to customize constructs for zebrafish transgenesis”的研究論文。該研究以斑馬魚為例，創(chuàng)建了一套方便快捷的轉(zhuǎn)基因外源質(zhì)粒構(gòu)建系統(tǒng)——GoldenFish，以期快速高效地服務(wù)于轉(zhuǎn)基因斑馬魚的構(gòu)建。

  GoldenFish系統(tǒng)以Golden gate克隆技術(shù)為原理，利用IIS型限制性內(nèi)切酶識別位點和切割位點位置不同的特點，通過人為設(shè)計切割位點，實現(xiàn)黏性末端的自由定制。經(jīng)過IIS型限制性內(nèi)切酶消化后，識別位點將從正確連接的DNA構(gòu)建體中移除，隨后，多個DNA片段可以通過懸垂互補進行連接，并按照正確順序和方向串聯(lián)起來。

  作者首先將外源質(zhì)粒的組成元件根據(jù)不同功能劃分為啟動子元件庫（P library）、目的基因元件庫（G library）和終止子元件庫（T library）三部分。在IIS型限制性內(nèi)切酶BsmBI的作用下使每種元件庫中的模塊帶上不同的接頭，以方便將各種組件按照對應(yīng)的接頭進行拼接，通過各種排列組合使得轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒像拼裝“樂高積木”一樣組裝為一體，每一個“樂高積木”都可以以質(zhì)粒形式長期保存及再次使用。
除此之外，GoldenFish技術(shù)還可以實現(xiàn)一步構(gòu)建多轉(zhuǎn)基因外源質(zhì)粒，即將P-G-T構(gòu)建體串連起來，在同一條DNA鏈中由多個啟動子來驅(qū)動單個或多個基因，生成多轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體(P-G-T)n。多轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒的構(gòu)建主要分為兩步，第一步利用BsmBI和T4連接酶，定向組裝各個元件庫中的模塊，生成1級連接產(chǎn)物。第二步，利用另一種IIS型限制性內(nèi)切酶BsaI和T4連接酶反應(yīng)，再將多個１級連接產(chǎn)物進行拼接生成2級連接產(chǎn)物。目前該系統(tǒng)中的元件庫模塊已經(jīng)擴充并涵蓋斑馬魚多種組織特異性啟動子以及大多數(shù)經(jīng)典熒光蛋白基因，方便后續(xù)直接組裝連接。

  該系統(tǒng)具有以下優(yōu)點：1、能夠?qū)崿F(xiàn)幾乎所有類型的外源轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒的構(gòu)建，包括單轉(zhuǎn)基因，一轉(zhuǎn)多基因，多轉(zhuǎn)基因等，尤其是它可以一步生成包含多個轉(zhuǎn)錄單元的構(gòu)建體。2、“樂高積木”式模塊使得DNA構(gòu)建體可以隨時個性化定制，一步完成克隆，顯著提高生成轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的速度和效率。3、存儲在同一元件庫中的模塊可以等效替換和重復使用，為構(gòu)建不同的DNA質(zhì)粒提供便利。4、GoldenFish系統(tǒng)除了可以構(gòu)建斑馬魚轉(zhuǎn)基因系之外，還可以通過合理的改造，將該系統(tǒng)擴展到其他轉(zhuǎn)基因動物。

西南大學博士研究生蔣展眉為論文的第一作者，中科院重慶綠色智能技術(shù)研究院陳靜影副研究員和西南大學楊昀副教授為論文通訊作者。