陳靜影／楊昀組合作創(chuàng)建一套方便快捷的轉(zhuǎn)基因斑馬魚外源質(zhì)粒構(gòu)建系統(tǒng)—GoldenFish

作者：CZRC 發(fā)布時(shí)間：2023/1/6 11:15:00

傳統(tǒng)手段依賴亞克隆產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因外源質(zhì)粒[1, 2]，對(duì)于生成復(fù)雜的DNA構(gòu)建體具有一定的局限性，其需要使用不同的II型限制性內(nèi)切酶切割和多次亞克隆連接，效率低且耗時(shí)長(zhǎng)。為此，催生出了一系列克隆工具如Gateway[3]、In-Fusion[4]和Gibson[5]等，雖然這些方法大大改進(jìn)了克隆效率，但由于其自身的特點(diǎn)，很難形成一套系統(tǒng)的方法運(yùn)用于轉(zhuǎn)基因外源質(zhì)粒的構(gòu)建，如引入的重組位點(diǎn)可能影響基因和蛋白功能；多輪PCR容易引入突變且這些突變只有在整個(gè)連接完成后才能檢測(cè)出來；線性化片段不利于長(zhǎng)期保存和二次利用；難以連接同源性高的相似基因片段等。

 

鑒于此，2022年12月24日，中國(guó)科學(xué)院重慶綠色智能技術(shù)研究院陳靜影副研究員與西南大學(xué)楊昀副教授課題組合作在Journal of Molecular Cell Biology上在線發(fā)表了題為“GoldenFish: a rapid and efficient system to customize constructs for zebrafish transgenesis”的研究論文。該研究以斑馬魚為例，創(chuàng)建了一套方便快捷的轉(zhuǎn)基因外源質(zhì)粒構(gòu)建系統(tǒng)——GoldenFish，以期快速高效地服務(wù)于轉(zhuǎn)基因斑馬魚的構(gòu)建。
 

 

GoldenFish系統(tǒng)以Golden gate克隆技術(shù)為原理[6]，利用IIS型限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)位置不同的特點(diǎn)，通過人為設(shè)計(jì)切割位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)黏性末端的自由定制。經(jīng)過IIS型限制性內(nèi)切酶消化后，識(shí)別位點(diǎn)將從正確連接的DNA構(gòu)建體中移除，隨后，多個(gè)DNA片段可以通過懸垂互補(bǔ)進(jìn)行連接，并按照正確順序和方向串聯(lián)起來。

 

作者首先將外源質(zhì)粒的組成元件根據(jù)不同功能劃分為啟動(dòng)子元件庫(kù)（P library）、目的基因元件庫(kù)（G library）和終止子元件庫(kù)（T library）三部分。在IIS型限制性內(nèi)切酶BsmBI的作用下使每種元件庫(kù)中的模塊帶上不同的接頭，以方便將各種組件按照對(duì)應(yīng)的接頭進(jìn)行拼接，通過各種排列組合使得轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒像拼裝“樂高積木”一樣組裝為一體（圖1），每一個(gè)“樂高積木”都可以以質(zhì)粒形式長(zhǎng)期保存及再次使用。
 

圖1 GoldenFish系統(tǒng)中P-G-T構(gòu)建體的生成

 

除此之外，GoldenFish技術(shù)還可以實(shí)現(xiàn)一步構(gòu)建多轉(zhuǎn)基因外源質(zhì)粒，即將P-G-T構(gòu)建體串連起來，在同一條DNA鏈中由多個(gè)啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)單個(gè)或多個(gè)基因，生成多轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體(P-G-T)n。多轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒的構(gòu)建主要分為兩步，第一步利用BsmBI和T4連接酶，定向組裝各個(gè)元件庫(kù)中的模塊，生成1級(jí)連接產(chǎn)物。第二步，利用另一種IIS型限制性內(nèi)切酶BsaI和T4連接酶反應(yīng)，再將多個(gè)１級(jí)連接產(chǎn)物進(jìn)行拼接生成2級(jí)連接產(chǎn)物（圖2）。目前該系統(tǒng)中的元件庫(kù)模塊已經(jīng)擴(kuò)充并涵蓋斑馬魚多種組織特異性啟動(dòng)子以及大多數(shù)經(jīng)典熒光蛋白基因，方便后續(xù)直接組裝連接。
 

圖2 GoldenFish系統(tǒng)中(P-G-T)n結(jié)構(gòu)的構(gòu)建
 

該系統(tǒng)具有以下優(yōu)點(diǎn)：1、能夠?qū)崿F(xiàn)幾乎所有類型的外源轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒的構(gòu)建，包括單轉(zhuǎn)基因，一轉(zhuǎn)多基因，多轉(zhuǎn)基因等，尤其是它可以一步生成包含多個(gè)轉(zhuǎn)錄單元的構(gòu)建體。2、“樂高積木”式模塊使得DNA構(gòu)建體可以隨時(shí)個(gè)性化定制，一步完成克隆，顯著提高生成轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的速度和效率。3、存儲(chǔ)在同一元件庫(kù)中的模塊可以等效替換和重復(fù)使用，為構(gòu)建不同的DNA質(zhì)粒提供便利。4、GoldenFish系統(tǒng)除了可以構(gòu)建斑馬魚轉(zhuǎn)基因系之外，還可以通過合理的改造，將該系統(tǒng)擴(kuò)展到其他轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

 

西南大學(xué)博士研究生蔣展眉為論文的第一作者，中科院重慶綠色智能技術(shù)研究院陳靜影副研究員和西南大學(xué)楊昀副教授為論文通訊作者。

 

參考文獻(xiàn)：

1. Cohen, S.N., et al., Construction of Biologically Functional Bacterial Plasmids in-Vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1973. 70(11): p. 3240-3244.

2. Roberts, R.J., How restriction enzymes became the workhorses of molecular biology. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005. 102(17): p. 5905-8.

3. Hartley, J.L., G.F. Temple, and M.A. Brasch, DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Res, 2000. 10(11): p. 1788-95.

4. Sleight, S.C., et al., In-Fusion BioBrick assembly and re-engineering. Nucleic Acids Res, 2010. 38(8): p. 2624-36.

5. Gibson, D.G., et al., Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods, 2009. 6(5): p. 343-5.

6. Engler, C., R. Kandzia, and S. Marillonnet, A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One, 2008. 3(11): p. e3647.