一、斑馬魚作為模式生物應用的優(yōu)勢

斑馬魚作為模式生物的使用最早可追溯至20世紀60年代^［1］，最初被應用于脊椎動物發(fā)育的研究。自20世紀80年代以來，隨著斑馬魚全基因組測序的完成與基因編輯操作技術的發(fā)展^［2］，斑馬魚作為模式生物被廣泛應用于研究基因功能、探討致病基因的作用機制、建立疾病模型用于治療藥物的篩選等。斑馬魚是重要的脊椎動物模型，同時又具有無脊椎動物的某些典型特征，填補了細胞培養(yǎng)和嚙齒動物之間的空白。

 

（一）斑馬魚遺傳操作技術方法快捷

近年來，斑馬魚模式生物主要是通過反向遺傳學原理進行造模。采用斑馬魚胚胎顯微注射技術向1~4細胞期的胚胎中注射嗎啉環(huán)修飾的嗎啉代反義寡核苷酸（morpholino，MO），干擾mRNA前體剪切或翻譯，可以短暫抑制特定基因的表達，一般維持3 d左右。這種反義寡核苷酸技術主要應用于暫時性敲降在斑馬魚早期胚胎發(fā)育中有表達的目的基因，快速簡便。而采用基因編輯技術則可產(chǎn)生穩(wěn)定突變體的斑馬魚，包括鋅指核酸酶（zinc finger nucleases）技術、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases）技術以及CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/Cas9（CRISPR-associated protein 9）技術。通過基因工程改造的核酸酶可以精確靶向誘導雙鏈 DNA 斷裂（double strand break），誘導生物體通過非同源末端連接（non-homologous end joining）或同源重組（homology-directed repair）方式進行修復，從而實現(xiàn)定點敲除、插入、缺失或者堿基置換，以達到構建永久性基因敲入/敲除斑馬魚模型的目的。向斑馬魚早期胚胎注射DNA或RNA可實現(xiàn)外源基因短期過表達，而利用轉(zhuǎn)基因技術可構建穩(wěn)定遺傳的插入品系，調(diào)控靶基因的持續(xù)表達，從而研究目的基因的生物學功能。

 

（二）斑馬魚肌肉表型分析可實現(xiàn)多元化和客觀量化

斑馬魚具有典型的運動行為，易于觀察和評價，肌肉發(fā)育迅速，在受精后17 h開始自發(fā)收縮。到了受精后24 h，肌節(jié)開始出現(xiàn)，胚胎能夠卷曲甚至對觸碰作出反應。受精后48 h肌肉分化完全，幼魚在受精后96 h可自由游動^［3］。利用胚胎自發(fā)卷繞和觸碰誘發(fā)的幼魚逃避反應，可以簡單直接地評估斑馬魚肌病模型的運動功能^［4］。也可通過視頻記錄一定時間內(nèi)斑馬魚的游動軌跡，分析其運動距離和運動時間，以比較運動能力的改變。

 

斑馬魚有較為完整的評價體系來評估其肌肉結(jié)構。骨骼肌在斑馬魚軀干中占相當大的比例，其肌節(jié)的超微結(jié)構和收縮特性均與人類肌肉有著極高的相似性^［5］。斑馬魚骨骼肌高度有序的肌節(jié)形狀在偏振光下顯得明亮，其雙折射特性使肌肉結(jié)構損傷的定量評估成為可能。研究人員可以通過雙折射分析在活體或固定標本上快速、無創(chuàng)地評估肌肉結(jié)構的破壞情況^［6］。斑馬魚的胚胎透明特性有利于肌肉發(fā)育的監(jiān)測，利用轉(zhuǎn)基因技術可以將外源熒光蛋白基因單獨或作為融合蛋白的一部分導入斑馬魚胚胎，目前已有較為成熟的標記斑馬魚肌肉結(jié)構的轉(zhuǎn)基因斑馬魚系如Tg2（smyhc1：EGFP）^［7］。也可利用免疫組織化學、免疫熒光技術進行斑馬魚肌病模型中肌纖維和肌節(jié)結(jié)構缺陷的觀察。

二、斑馬魚作為模式生物在遺傳性肌肉疾病研究中的應用

遺傳性肌病新的致病基因及眾多意義未明的變異位點的致病性都亟需動物模型驗證，同時，此類疾病治療手段的匱乏也要求強大的篩選平臺以支持干預措施的研究。鑒于以上斑馬魚作為模式生物的顯著優(yōu)勢，如能推動斑馬魚在遺傳性肌肉疾病領域的應用，可以更好地應對基因檢測技術普及帶來的機遇與挑戰(zhàn)，促進遺傳性肌肉疾病致病機制的研究及潛在藥物的發(fā)現(xiàn)。下面簡述斑馬魚作為肌肉疾病模式生物代表性的研究應用，以啟發(fā)科研工作者開拓視野，促進研究領域?qū)W術發(fā)展。

 

（一）遺傳性肌肉疾病致病基因的驗證

遺傳性肌肉疾病多具有顯著的遺傳異質(zhì)性，尤其是肌營養(yǎng)不良、先天性肌病等^［8］，這些疾病的癥狀往往相互重疊，僅通過臨床表型無法準確判斷疾病的亞型，因此需要借助分子遺傳學手段進行精準診斷，并以此為基礎開展遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷。另外，隨著基因檢測成本的降低，研究者發(fā)現(xiàn)了大量臨床意義未明的變異，持續(xù)不斷地擴大著肌病相關的基因突變譜系。然而，未報道過的新基因或變異位點需慎重判斷其致病性，有效的動物模型往往能提供可靠的證據(jù)。

 

斑馬魚骨骼肌生長和發(fā)育過程高度保守，80%以上與人類肌肉疾病有關的基因都可以在斑馬魚基因組中找到同源基因，包括編碼抗肌萎縮蛋白-糖蛋白復合物、興奮-收縮耦聯(lián)組分等基因^{［9, 10, 11］}，這意味著斑馬魚非常適合作為構建遺傳性肌肉疾病的模型。另一方面，相較于國內(nèi)常用的小鼠模型，斑馬魚體外受精易于對胚胎進行遺傳學操作，降低了建模難度。另外，一對健康成年斑馬魚一次交配可產(chǎn)卵200枚以上，產(chǎn)卵間隔僅1周，且發(fā)育迅速，極大地縮短了模型構建周期。

 

（二）遺傳性肌肉疾病致病機制的研究

相對于細胞和組織層面，利用斑馬魚來研究疾病的分子機制是在體內(nèi)模型的層面，更容易得出讓人信服的結(jié)論，可在一定程度上替代體外模型。借助整胚原位雜交技術、免疫熒光技術等，能在胚胎組織或細胞結(jié)構不被破壞的條件下，從整體上把握肌病背景下相關分子mRNA及蛋白水平的改變。熒光探針技術可實現(xiàn)在斑馬魚活體水平標記疾病相關靶點，并可在病理狀態(tài)下觀察其動態(tài)改變。

 

此外，斑馬魚信號傳導通路與人類近似，氧化應激水平增加與RyR1相關肌病、自噬功能受損與肌原纖維肌病等都得到了斑馬魚模型證據(jù)的支持。ryr突變幼魚細胞應激相關的部分通路發(fā)生了顯著改變，特別是氧化應激標記基因表達的增加^［12］。Bag3缺乏的斑馬魚肌肉電鏡下可觀察到自噬囊泡結(jié)構異常，誘導自噬流后免疫印跡顯示自噬標志物微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ積聚減少，表明其自噬活性受損^［13］。

 

（三）遺傳性肌肉疾病治療靶點的篩選

結(jié)合高通量測序及肌肉病理分析，遺傳性肌病大多數(shù)已經(jīng)可以得到精準診斷，但絕大部分遺傳性肌病仍然缺乏有效的干預手段，相當一部分患者并未因精準診斷而獲益，因此遺傳性肌病未來研究的重點應該放在新型藥物研發(fā)和基因治療等領域。斑馬魚模型既可以像體外實驗那樣對作用靶點明確的候選化合物進行靶向篩選，也可以像哺乳動物一樣對靶點不明或致病機制不明的疾病進行基于藥效學的干預藥物篩選和評價，能夠提高藥物早期藥效學評價的靈敏性和可靠性，還可以進行基因編輯治療的探索。如果能將斑馬魚模型和哺乳動物模型相結(jié)合，可以從整體上縮短干預藥物或措施的研發(fā)實驗周期，降低成本和風險，提高研發(fā)效率。

 

與嚙齒類動物相比，斑馬魚易飼養(yǎng)、體積小，其胚胎可以在96孔或384孔板中培養(yǎng)。而且在培養(yǎng)皿中的斑馬魚胚胎可以直接吸收添加至培養(yǎng)液中的藥物，適合進行中到高通量的藥物篩選的初步研究。基于斑馬魚的迪謝內(nèi)肌營養(yǎng)不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）模型已篩選了超過4 500種小分子化合物^［14］，發(fā)現(xiàn)了至少25種有效藥物，如非選擇性磷酸二酯酶抑制劑氨茶堿^［15］、選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑氟西汀^［16］、靶向血紅素加氧酶信號通路的西地那非^［17］等。除上述靶向參與DMD發(fā)病機制相關途徑來改善肌肉功能和質(zhì)量，斑馬魚模型也適用于評價基因組編輯療法、基因產(chǎn)物修飾如外顯子跳躍和終止密碼子通讀等基因治療策略。有研究者向dystrophin基因無義突變的斑馬魚胚胎中注射影響轉(zhuǎn)錄物剪接的MO，將攜帶突變的外顯子從成熟的mRNA中去除，恢復了部分dystrophin蛋白的功能，斑馬魚肌節(jié)結(jié)構顯著改善，從而證實了外顯子跳躍治療策略的可行性^［18］。

三、斑馬魚模型應用的局限性

首先，斑馬魚組織解剖結(jié)構與人類的相似性不如小鼠，如哺乳動物快肌與慢肌相間分布，而斑馬魚快肌與慢肌在位置上完全分離。其次，針對斑馬魚的抗體種類較少，定制斑馬魚抗體耗時且成本較高，一定程度上限制了分子機制的研究。此外，浸泡給藥方式無法準確控制藥物攝取量，斑馬魚的藥物代謝系統(tǒng)與人類有一定差異，給藥物臨床轉(zhuǎn)化帶來困難。另外，斑馬魚肌肉疾病模型的質(zhì)量控制尤為重要，不能僅以斑馬魚形態(tài)和運動功能等非特異性改變?yōu)樵u價標準，必須有如桿狀體、中央核或軸空等病理組織化學特征以及dystrophin蛋白的表達缺失等分子病理特征支持^{［19, 20］}，以產(chǎn)生符合人類疾病特征又可擴展用于高通量藥物篩選的可靠疾病模型。

四、展望

由于斑馬魚模型在遺傳和胚胎操作以及肌肉結(jié)構和功能評價方面的優(yōu)勢，近年來備受研究人員青睞，在國際上已被廣泛應用于肌肉疾病發(fā)病機制的研究和治療開發(fā)，且已取得了一系列令人振奮的研究成果。展望未來，生命與健康領域中最富創(chuàng)造力的將是新藥研發(fā)，斑馬魚模型憑借體外細胞培養(yǎng)和其他模式動物不可替代的獨特優(yōu)勢，將成為大規(guī)?；瘜W藥物篩選和探索基因治療的強大工具，也必將為人類逐漸征服遺傳性肌肉疾病發(fā)揮重要作用。